1.   先進激光偏振器

1.1    儀器運作原理

1.2    與紫外和二圓色譜檢測器的比較

1.3    儀器使用方法原則

1.4    分析物

1.5    儀器的使用

1.6    概要及總結




選用ALP的優勢：

●     對旋光度的靈敏性

●     不受吸光度的影響

●     非常寬的線性變化範圍（一百萬）

●     使用壽命長（無故障時間10年）——不需要換燈

●     可適配許多HPLC和SFC的流通池

●  自動化的運行理念：- 不需要用戶校正

                                          - 掃描時不需要停止流動

                                          - 實時數據

ALP的應用：

●     確認對映體的分離

●     識別對映體的洗脫規律

●     測量允許誤差和對映體的旋轉程度

●     控制純化過程中的片段切除

●     不用生色團即可檢測對映體

●     在化學反應中引導或控制旋光性的改變

●     引導或控制蛋白質或肽的合成

ALP實時測量流通池中所含的各種化合物的旋光性，在HPLC或SFC系統運行時測量結果是動態的，但是如果流通池中的樣品是固定的，檢測結果也將固定。如在測量變化範圍內沒有干擾和非線性因素表現出來，ALP可以直接測量旋光度。

由於從微克到噸級的極大差別的分析範圍內的操作單元間有緊密的聯繫，這些可供選擇的和固定的特征使同樣的光柵技術可以應用到從分析物到預備物和產品的檢驗中。特定分析物的旋光度的測量依賴於包括探測波長在內的很多參數。在200到400納米間變化是因為波長太大，典型情況就是零通過（無信號）。多數情況下變化和零通過是因為波長沒超過500納米太多，傳統的偏振器用鈉燈發射出590納米的光線，現化的激光偏振器用二極管激光發出670納米的激光線，在590和670納米間的波長測量是非常穩定的，用不含影響吸光度的干擾物檢測了重複性並同時証明短波長在某些情況下會產生問題。旋光度的測量也會被溶劑影響，溫度也會影響旋光度檢測，但影響程度比溶劑低。

ALP的寬廣的線性變動範圍和比較容易的操作使他們做為進行自動手性分析的理想檢測器有了很大的發展，並增加了預精製系統。在方法建立中ALP將通過顯示對映體峰的正手性與反手性來確認對映體的分離。紫外檢測器通常比ALP更靈敏，但當外消旋物質和手性化合物沒有分開時，紫外檢測器無法通過峰的比較單獨分出對映體峰。

在預精製應用中，紫外檢測器越來越重的處理負擔傾向使ALP成為優先發展的技術。

當用ALP檢測和收集對映體峰時，幾乎所有的手性預處理工作都可以，而且在收集片段峰時，用來檢測雜質的紫外檢測器可以省略掉。

1.1儀器的運行原理
從高校的物理中我們知道光有一種近似波的特性（圖2A）。振動產生波並形成波峰和波谷。正常的兩個波峰或波谷之間的距離叫波長。波長和光的顏色相關，而振動的振幅和光的強度相關（圖2B），我們通常遇到的光包含許多光波，而且每個光波都在不同的平面內振動。也就是普通光在很多平面內振動（圖2C）。

光通過光學偏振柵后的光將被限制在特定的平面內振動。由於這種光被限制在一個特定的平面內偏振，就把這種光叫做平面偏振光。 

ALP的光學系統可以用下圖6來解釋，它包括一個二極管激光發生器，偏轉稜柱，法拉第偏轉儀，流通池，分析稜柱和光敏二極管。

來自二極管的激光通過偏振稜柱過濾后，高度偏振的光再通過法拉第偏轉器和流通池。法拉第偏轉器給偏振平面一個正弦偏轉。樣品的旋光度流過流通池后將抵消來自法拉第偏振儀的正弦偏轉從而達到零度轉動，正確地安裝激光偏轉稜鏡和特定的電子迴路將可以通過光敏二極管得到（化合物的）淨旋光度。因為法拉第偏轉器頻率在500Hz以上不可要求，所以可以連接獲得實時值。法拉第偏轉器用來反映和偏轉不同的信號（即噪音）變化。

1.2 與紫外和圓二色譜檢測器的對比

紫外和圓二色譜檢測器都是以吸收為基礎的檢測器，可以檢測同樣的化學性質。他們都要求分析物有一個生色團而且要用在生色團的吸收範圍內的波長的光去激發。

由於吸收過程中光電檢測器通量的增加，吸收會逐步接近零點，而此時噪音也在增加。所以紫外和圓二色譜的線性波動範圍就被限制（尤其是對圓二色譜檢測器而言）。除了生色團，圓二色譜檢測器也要一個和生色團相連的手性中心以檢測旋光度。紫外和圓二色譜檢測器常受溶劑梯度變化的影響，那些對吸收有干擾的物質對圓二色譜檢測器也有影響。

ALP檢測並不以吸收為基礎，所以ALP不要求有生色團和可匹配生色團吸收範圍的波長光。ALP通過測量平面偏振光的轉動角來檢測光學活性，這是對相的測量而不是振幅的測量，大的角度偏轉量只改變相角度而不減少光電探測器上的光通量。

由於分析物化學性質和色譜分析條件的變動還有儀器本身的變動，要進行靈敏度的對比很複雜，對大部分製藥類化合物，紫外比圓二色譜和ALP都靈敏，除此之外對於包括非生色團的化合物（如糖、維生素等），ALP更靈敏。如果把分析物正確在安放在流通池中，停止流動並用相應波長波掃描，而且最大信號波長波已經選出，那麼后序的圓二色譜對分析物的分析精度就可以和ALP相比了。由於ALP不需要校正不需要停止流通就可掃描並且有更大的線性波動範圍，在進行自動掃描分析和預精製上ALP幾乎總是表現得更好。

1.3 一些有用的常用語

——化學物純度（CP）

化學物純度是混合物中化合物的相應數量占總體的百分比。

CP=CP/MT×100     CP是目標化合物，MT是總的混合物

——對映體純度（EP）

對映體純度是混合物中對映體占混合物中兩種對映體總數的比例

EP=EA/（EA+EB）×100  EA是目標對映體，EB是另一種對映體

——對映體過余量（EE）

對映體過余量是混合物中未成對的對映體或超過成對的量

EE=（EA-EB）/（EA+EB）  EA、EB是對映體

在描述手性混合物時對映體過余量是最常用的常數

——旋光度（SR）

對比旋光度是一個常用值，它在對比不同化合物的旋光度和專利申請時非常有用，為了比較對映體的旋光度，需要特定化溶劑、波長和測量溫度。

     [α]=特定旋光度

                α=測得的旋光度     l=相互作用長度（分米）

                c=濃度（g/ml）

1.4 分析物

本節簡要介紹可以成功用ALP測量的分析物的級別。

小分子製藥候選藥物

大部分小分子製藥品是包含1個或更多手性中心的手性化合物，在發展和生產這些化合物的許多應用上ALP都是非常有用的，他們可以在眾多的紫外和質譜峰中正確地分出手性峰，定量地測對映體的分離和純化，在對映體片段純化中直接預準備片段收集器。ALP通常不會被洗脫液梯度影響，並且在不需要特別照顧時就使用許多年，因為二極管激光發生器有10年以上的使用壽命。

目前市場上有大量含有一個手性中心的藥物，大部分這些化合物作為純對映體出售。過去几十年在純的同分異構體中用手性色譜分析法分離對映體已經是非常普遍，但是隨着分子中手性中心數量的增加，同分異構體數和色譜分析法的複雜度也迅速增加。當一個分子包含有兩個非對稱中心它可能有四個同分異構體：二個非對映體，每個又有兩個對映體（注意：有2ⁿ個可能的同分異構體，n為手性中心數），非對映體是立體同分異構體，這些立體同分異構體有2個及2個以上的手性中心，且相互之間並不是對映體。對映體有同樣的化學和物理性質，但非對映異構體通常化學與物理性質並不相同。因此大多數時候非對映異構體可以用標準反相色譜法分離，然而在非對映異構體對中對映體對並不能用這種方式分離，而要用手性色譜分析法分析技術。對一個含有2個立體手性中心的化合物（2ⁿ=4個可能的同分異構體），僅僅用紫外檢測器，如果要辨別和通過手性色譜分析法進行辨別和對映體配對是比較困難的，除非四種同分異構體作為標準參考物質可以得到。用紫外檢測器和測偏振光的檢測器組合成手性分離器非常有用，看圖七的色譜分析。

這個現象的例子是抗高血壓藥拉貝洛爾，色譜分析結果如圖七，用的是ASTEC Chirobionc V型手性柱，4.6mm×25cm，流動相為MeOH/HOAc/TEA(100/0.15/0.05)­，流速為1ml/min。藍色色譜圖是紫外檢測器的掃描結果，紅色色譜圖是ALP檢測器的掃描結果，這兩組對映體在這些條件下分成四個化合物，如果只用紫外掃描，它是不可能的從每組對映體中分出某個峰。但是用ALP可以得到另外的一些信息，第一和第三個峰來自一組對映體，第二和第四峰物質組成另一組對映體。一個正極性峰和一個負極性峰在一個地方，而另一個正極和負極峰在不同的地方（在ALP圖上），這是每一組有同樣中心的正負部分有不同特定偏轉度的結果。以正極峰和負極峰可得到的結論，指示出了在這些檢測條件下的旋光度的旋轉方向，也包括了這些曲線的面積（注意：1和3曲線下的面積比峰2和4曲線下的面積小）。

以上例為基礎，很容易知道用偏振光檢測器可以得到包含2個以上立體手性中心的化合物的有用信息。

藥品拉貝洛爾同分異構體的結構可以用圖8解釋，大部分小分子藥物制備體表現出的特定旋光性在10和40度之間。

抗生素和糖：沒有生色團的化合物

大部分抗生素和糖類物質沒有生色團但卻表現出特定的在100度以上的旋光度。這意味着對小分子藥物制備劑而言以吸收為基礎的檢測器（紫外和圓二色譜）將失效，而ALP將有很大高的靈敏度。

像慶大黴素和紅黴素等抗生素有多種結構上的類似物，這類似物在質量上的差別通常小於2%，而且紫外檢測器在220納米以上時通常無法檢測，但對此類似物儘管其結構上的差異很小，可其比旋光度卻有很大的不同。所以ALP不僅可以檢測出來類似物而且可以通過其特定的旋光度確認抗生素種類。

在細菌感染對生命造成潛在威脅時慶大黴素可以提高人的抵抗力，但慶大黴素的治療範圍不寬，過量的慶大黴素會引起腎和聽覺神經的損害，所以需要持續地觀察，出人意料的是慶大黴素的化學性質穩定並在動物飼養界應用很廣。在不損失生物活性的情況下慶大黴素可以在不斷升溫的環境中保留一段時間。

ALP可以持續的測量手性物質的信號和旋光度，通過保留時間來指示氨基酸種類。ALP可以在不持續用外標物時就定性和定量分析氨基酸。

天然產物

天然物是手性的並且可以表現出旋光度。很多化合物僅以一種對映體形式表現出手性。存在於柑桔類水果、香菜、時羅葉、佛手桔等中的聚檸檬烯和油性化合物等有l和d兩種手性結構。檸檬烯的比旋光度大約是101度。

食物、味精和香料

由於嘗的和聞的是手性化合物的效應，食物、味精和香料也可以用ALP進行分析。

肥料和殺虫劑

許多手性小分子物料在提高效力和專一性並減少毒性上效果顯著，因此許多新的和在開發的肥料和殺虫劑都是手性的。ALP在分析和控制這些化合物的合成過程中非常有用。

P、P‘-DDT和P、P‘-DDD這兩個聲名狼藉的殺虫劑是讓環境化學家非常頭疼的。因為它們是不可降解的和生物活性。作為殺虫劑，它的生物活性超過了它的毒性，而且它對脊椎動物的毒物活性還是不可預測的。除此之外這些還是一類被指出有內分泌干擾功能的化合物。因此監測土壤、地表和地下水中的DDT和DDD的含量有非常重要的價值。

儘管這兩個殺虫劑都是手性的，但卻沒有表現出旋光度，商業生產的制劑中含有OP‘對映體類似物10-20%，這是有旋光度的（見圖13），通過監測環境樣品中這類似物的存在，就可大體確定手性物的存在，從而暗示出有毒化合物的存在。

1.5 應用

大部分ALP用於測量、方法開發、準備工作純化和過程控制，如下面所描述那樣，在其它的應用上只對旋光度靈敏是其獨一無二的特點。由於不依賴吸收效應，可以在對分析物和過程問題的分析中改變溶劑，如ALP可以通過減少或增加分離物和要求的標準物來簡化分析和對複雜的有機化合物中手性化合物的監測過程

分析（數量分析和質量分析）

ALP檢測流通池中的含有物的淨旋光度的方向和含量。當在HPLC和SFC系統的紫外檢測器后再接一個ALP，紫外檢測器可以通過檢測吸光度來反映樣品質量，而ALP則檢測其旋光度，如可得到紫外和ALP檢測器的相對響應係數，可以實時對對映體峰重疊部分和對映體超出部分的峰進行卷積。計算比旋光度將會更容易。

例子一：剩餘在牛奶中的抗生素——慶大黴素的質量控制和質量管理：

在細菌感染對生命造成潛在威脅時慶大黴素可以提高人的抵抗力，但慶大黴素的治療範圍不寬，過量的慶大黴素會引起腎和聽覺神經的損害，所以需要持續地觀察，出人意料的是慶大黴素的化學性質穩定並在動物飼養界應用很廣。在不損失生物活性的情況下慶大黴素可以在不斷升溫的環境中保留一段時間。慶大黴素的四種光學活性類似物如圖14的圖片所示。

上圖顯示的是用ALP檢測器對兩種不同商家提供的慶大黴素類似物的分析，分離用的是反相、離子交換柱，洗脫液的組成是甲醇和0.4MTFA/H₂O（80：20，V：V），流速為0.75ml/min，總進樣體積是10μg。

這是第一個用單一分離系統對四種慶大黴素類似物進行徹底分離。ALP可以在不用衍生化反應檢測出低於50ng的慶大黴素，用紫外檢測器時，衍生化反應增加的劑量決定了整個色譜分離的衍生物的特性，從而使分離開四種同類物幾乎成為不可能。隨着四種同類物的分離，兩個商家提供的樣品中所含的四種化合物的不同清晰地表現出來。判斷衍生物慶大黴素的來源就有了可能。

早先由於檢測和分離四種類似物很困難，只報道過對映體混合物的旋光度，隨着四種慶大黴素類似物的分離，ALP可以用來決定四種物質中每一種物質的旋光度，首先用示差折光檢測器指出分離試驗中每一種對映體的相對質量，用檢測每種物質旋光度和相對豐度，可以得到混合物的計算量，這個計算量和文獻中找到的可接受值一致，結構上這四種物質也可以真正地鑑別開來。旋光度可以清晰地分離不僅反映出ALP檢測器的靈敏性，而且表明瞭旋光度和靠近或在手性中心的原子的密切關係。

為了檢測可能有污染物的大量牛奶樣品，檢測方法必須是快速且靈敏的。選擇ALP檢測器在這個應用中是有很大的優勢的。如果用此方案。用0.1mol三氟醋酸酸化牛奶樣品，離心分離5min，取上清液注入HPLC。HPLC的條件和上面的一樣，離子對分離。紫外檢測器顯示出大量的化合物存在提取液中，然後它們中的大部分沒有旋光度而不能讓ALP識別，我們期望分離的物質在2min后被洗脫出來，用ALP檢測器，慶大黴素污染物很容易觀察出來 而含有慶大黴素污染樣品的提供者也可以很快確定。整個分析過程不到15min，與用紫外檢測器抽提、清洗和衍生化方案相比，這是一個很大的進步。紫外檢測器是需要好幾個小時才能檢測出來，所以基本排除了在大量的牛奶樣品檢測上應用的可能性。

HPLC/SFC方法開發

ALP的使用是手性方法，因為他們可以不考慮溶劑就精確地識別對映體並在非手性雜質和手性物質混合時顯示對映體的分離。含有多個手性中心的化合物表現出了對映體之間旋光度的明顯差別。這個特點使ALP更容易在非對映體異構體和複雜的化合物的分離中識別和定性各個峰。

HPLC/SFC預純化——片段收集器

ALP是手性預處理中選擇的檢測器，他們表現出可持續地檢測旋光度且不被手性化合物和溶劑影響。ALP可以正常使用很長時間而不用校正和特別保養。非常重要的線性波支範圍上ALP也比任何其它以吸收為基礎的檢測器技術更好，而流通池技術也是幾乎和任何其它應用相適應的。大部分用ALP的預處理實驗可以用ALP系統完成收集，而紫外檢測器則另外單獨尋找手性雜質。

在線監測

以下部分演示了用ALP監視的將有一種旋光度的手性反應物轉變為一個有不同旋光度的產品的過程，圖17顯示了在葡萄糖氧化酶催化以下反應過程中如何改變旋光度的。反應物β—D—葡萄糖的旋光度是53（deg.(g/ml)^-1dm^-1）,而產生葡萄糖酸的旋光度是12.7（deg.(g/ml)^-1dm^-1），因此反應結果用旋光度α的淨改變量表示大約是30。它很容易用ALP測量出來。

在此實驗中，反應是在偏振光檢測器流通池中進行的。下面我們將演示怎麼以固定的時間間隔從反應器中提取樣品並用ALP分析。當然為了實時控制連續運行的反應系統，此檢測器可以作為在線監視器作其它用途。

圖18的數據顯示了ALP怎樣利用流動進樣分析系統引入樣品的，葡萄糖和葡萄糖酸注射量加倍后，大約40秒后分離並核實洗脫順序和檢測器對兩個有旋光度的化合物的響應值。

β—D—葡萄糖先洗脫下來，比2分鐘后洗脫下來的D—G—葡萄糖酸的響應值大，這和文獻中報道的α值相一致。這給了我們一個快速準確分析反應系統的有用工具。圖19中，我們把ALP響應值作為β—D—葡萄糖分子片段的函數，在此顯示出的數據顯示出當一個有手性的化合物轉為一個旋光度不同或無旋光度的化合物時用一個偏振光檢測器可以很容易地追蹤反應過程。

當用葡萄糖酸的分子片段繪圖時可以得到一個相似的曲線，只是因為葡萄糖酸的旋光度更小一些使斜率更小。

圖20展示了收集數據製成的圖，此圖解釋了在用在線分析和控制優化涉及手性化合物的反應時的一些潛在可能性。通過偏振光檢測器葡萄糖轉為葡萄糖酸，用FIA將來自反應器中的樣品注入ALP，在此實驗中，反應時間50分鐘。然而其它的研究擴展到長達12小時，酶本身的旋光度導致了反應培養基開始旋光度的不同。

我們可以清晰地看到主要是葡萄糖氧化酶催化劑數量的增加導致了反應速率的上升。需要注意此時沒有使用分離。通過用FIA，每個樣品用不到3分鐘來分析收集數據的潛在增加值並和其它技術如HPLC作對比。

在下頁的表2中，我們列出了適合用ALP檢測器監測的大量藥物和工業用酶系統，這些系統的任一個都將受益于ALP的優化過程。

ALP可用在許多大規模分離應用如液相分析和SFC以及模擬移動床系統上。ALP可以用在任何規模的反應器或結晶罐中的化合物的旋光度的實時變化的監測上。旋光度的變化是對映體的濃縮或手性反應物轉變為旋光度不同的手性產品的結果。一般這些測量可以實時取得並不需分離過程中關閉來自反應器的循環流路。ALP測量不受吸收值改變的影響，也不受測量流中沒有旋光度的干擾物的影響。

1.1              概要和結論

在過去10年里ALP在應用表現和用戶接受度上都取得了重大進展，在手性色譜分析中如果不用現代激光的ALP將是不可能的。ALP理所當然地支持手性色譜分析，這會帶來ALP在產量，穩定性和精確度上的提高，合理設計的ALP流通池也適用於HPLC、SFC和SMB，以及覆蓋從微克到噸級的樣品尺寸的應用過程。他們很容易自動化並不需要定期的校正和維修。