1.   先进激光偏振器

1.1    仪器运作原理

1.2    与紫外和二圆色谱检测器的比较

1.3    仪器使用方法原则

1.4    分析物

1.5    仪器的使用

1.6    概要及总结




选用ALP的优势：

●     对旋光度的灵敏性

●     不受吸光度的影响

●     非常宽的线性变化范围（一百万）

●     使用寿命长（无故障时间10年）——不需要换灯

●     可适配许多HPLC和SFC的流通池

●  自动化的运行理念：- 不需要用户校正

                                          - 扫描时不需要停止流动

                                          - 实时数据

ALP的应用：

●     确认对映体的分离

●     识别对映体的洗脱规律

●     测量允许误差和对映体的旋转程度

●     控制纯化过程中的片段切除

●     不用生色团即可检测对映体

●     在化学反应中引导或控制旋光性的改变

●     引导或控制蛋白质或肽的合成

ALP实时测量流通池中所含的各种化合物的旋光性，在HPLC或SFC系统运行时测量结果是动态的，但是如果流通池中的样品是固定的，检测结果也将固定。如在测量变化范围内没有干扰和非线性因素表现出来，ALP可以直接测量旋光度。

由于从微克到吨级的极大差别的分析范围内的操作单元间有紧密的联系，这些可供选择的和固定的特征使同样的光栅技术可以应用到从分析物到预备物和产品的检验中。特定分析物的旋光度的测量依赖于包括探测波长在内的很多参数。在200到400纳米间变化是因为波长太大，典型情况就是零通过（无信号）。多数情况下变化和零通过是因为波长没超过500纳米太多，传统的偏振器用钠灯发射出590纳米的光线，现化的激光偏振器用二极管激光发出670纳米的激光线，在590和670纳米间的波长测量是非常稳定的，用不含影响吸光度的干扰物检测了重复性并同时证明短波长在某些情况下会产生问题。旋光度的测量也会被溶剂影响，温度也会影响旋光度检测，但影响程度比溶剂低。

ALP的宽广的线性变动范围和比较容易的操作使他们做为进行自动手性分析的理想检测器有了很大的发展，并增加了预精制系统。在方法建立中ALP将通过显示对映体峰的正手性与反手性来确认对映体的分离。紫外检测器通常比ALP更灵敏，但当外消旋物质和手性化合物没有分开时，紫外检测器无法通过峰的比较单独分出对映体峰。

在预精制应用中，紫外检测器越来越重的处理负担倾向使ALP成为优先发展的技术。

当用ALP检测和收集对映体峰时，几乎所有的手性预处理工作都可以，而且在收集片段峰时，用来检测杂质的紫外检测器可以省略掉。

1.1仪器的运行原理
从高校的物理中我们知道光有一种近似波的特性（图2A）。振动产生波并形成波峰和波谷。正常的两个波峰或波谷之间的距离叫波长。波长和光的颜色相关，而振动的振幅和光的强度相关（图2B），我们通常遇到的光包含许多光波，而且每个光波都在不同的平面内振动。也就是普通光在很多平面内振动（图2C）。

光通过光学偏振栅后的光将被限制在特定的平面内振动。由于这种光被限制在一个特定的平面内偏振，就把这种光叫做平面偏振光。 

ALP的光学系统可以用下图6来解释，它包括一个二极管激光发生器，偏转棱柱，法拉第偏转仪，流通池，分析棱柱和光敏二极管。

来自二极管的激光通过偏振棱柱过滤后，高度偏振的光再通过法拉第偏转器和流通池。法拉第偏转器给偏振平面一个正弦偏转。样品的旋光度流过流通池后将抵消来自法拉第偏振仪的正弦偏转从而达到零度转动，正确地安装激光偏转棱镜和特定的电子回路将可以通过光敏二极管得到（化合物的）净旋光度。因为法拉第偏转器频率在500Hz以上不可要求，所以可以连接获得实时值。法拉第偏转器用来反映和偏转不同的信号（即噪音）变化。

1.2 与紫外和圆二色谱检测器的对比

紫外和圆二色谱检测器都是以吸收为基础的检测器，可以检测同样的化学性质。他们都要求分析物有一个生色团而且要用在生色团的吸收范围内的波长的光去激发。

由于吸收过程中光电检测器通量的增加，吸收会逐步接近零点，而此时噪音也在增加。所以紫外和圆二色谱的线性波动范围就被限制（尤其是对圆二色谱检测器而言）。除了生色团，圆二色谱检测器也要一个和生色团相连的手性中心以检测旋光度。紫外和圆二色谱检测器常受溶剂梯度变化的影响，那些对吸收有干扰的物质对圆二色谱检测器也有影响。

ALP检测并不以吸收为基础，所以ALP不要求有生色团和可匹配生色团吸收范围的波长光。ALP通过测量平面偏振光的转动角来检测光学活性，这是对相的测量而不是振幅的测量，大的角度偏转量只改变相角度而不减少光电探测器上的光通量。

由于分析物化学性质和色谱分析条件的变动还有仪器本身的变动，要进行灵敏度的对比很复杂，对大部分制药类化合物，紫外比圆二色谱和ALP都灵敏，除此之外对于包括非生色团的化合物（如糖、维生素等），ALP更灵敏。如果把分析物正确在安放在流通池中，停止流动并用相应波长波扫描，而且最大信号波长波已经选出，那么后序的圆二色谱对分析物的分析精度就可以和ALP相比了。由于ALP不需要校正不需要停止流通就可扫描并且有更大的线性波动范围，在进行自动扫描分析和预精制上ALP几乎总是表现得更好。

1.3 一些有用的常用语

——化学物纯度（CP）

化学物纯度是混合物中化合物的相应数量占总体的百分比。

CP=CP/MT×100     CP是目标化合物，MT是总的混合物

——对映体纯度（EP）

对映体纯度是混合物中对映体占混合物中两种对映体总数的比例

EP=EA/（EA+EB）×100  EA是目标对映体，EB是另一种对映体

——对映体过余量（EE）

对映体过余量是混合物中未成对的对映体或超过成对的量

EE=（EA-EB）/（EA+EB）  EA、EB是对映体

在描述手性混合物时对映体过余量是最常用的常数

——旋光度（SR）

对比旋光度是一个常用值，它在对比不同化合物的旋光度和专利申请时非常有用，为了比较对映体的旋光度，需要特定化溶剂、波长和测量温度。

     [α]=特定旋光度

                α=测得的旋光度     l=相互作用长度（分米）

                c=浓度（g/ml）

1.4 分析物

本节简要介绍可以成功用ALP测量的分析物的级别。

小分子制药候选药物

大部分小分子制药品是包含1个或更多手性中心的手性化合物，在发展和生产这些化合物的许多应用上ALP都是非常有用的，他们可以在众多的紫外和质谱峰中正确地分出手性峰，定量地测对映体的分离和纯化，在对映体片段纯化中直接预准备片段收集器。ALP通常不会被洗脱液梯度影响，并且在不需要特别照顾时就使用许多年，因为二极管激光发生器有10年以上的使用寿命。

目前市场上有大量含有一个手性中心的药物，大部分这些化合物作为纯对映体出售。过去几十年在纯的同分异构体中用手性色谱分析法分离对映体已经是非常普遍，但是随着分子中手性中心数量的增加，同分异构体数和色谱分析法的复杂度也迅速增加。当一个分子包含有两个非对称中心它可能有四个同分异构体：二个非对映体，每个又有两个对映体（注意：有2ⁿ个可能的同分异构体，n为手性中心数），非对映体是立体同分异构体，这些立体同分异构体有2个及2个以上的手性中心，且相互之间并不是对映体。对映体有同样的化学和物理性质，但非对映异构体通常化学与物理性质并不相同。因此大多数时候非对映异构体可以用标准反相色谱法分离，然而在非对映异构体对中对映体对并不能用这种方式分离，而要用手性色谱分析法分析技术。对一个含有2个立体手性中心的化合物（2ⁿ=4个可能的同分异构体），仅仅用紫外检测器，如果要辨别和通过手性色谱分析法进行辨别和对映体配对是比较困难的，除非四种同分异构体作为标准参考物质可以得到。用紫外检测器和测偏振光的检测器组合成手性分离器非常有用，看图七的色谱分析。

这个现象的例子是抗高血压药拉贝洛尔，色谱分析结果如图七，用的是ASTEC Chirobionc V型手性柱，4.6mm×25cm，流动相为MeOH/HOAc/TEA(100/0.15/0.05)­，流速为1ml/min。蓝色色谱图是紫外检测器的扫描结果，红色色谱图是ALP检测器的扫描结果，这两组对映体在这些条件下分成四个化合物，如果只用紫外扫描，它是不可能的从每组对映体中分出某个峰。但是用ALP可以得到另外的一些信息，第一和第三个峰来自一组对映体，第二和第四峰物质组成另一组对映体。一个正极性峰和一个负极性峰在一个地方，而另一个正极和负极峰在不同的地方（在ALP图上），这是每一组有同样中心的正负部分有不同特定偏转度的结果。以正极峰和负极峰可得到的结论，指示出了在这些检测条件下的旋光度的旋转方向，也包括了这些曲线的面积（注意：1和3曲线下的面积比峰2和4曲线下的面积小）。

以上例为基础，很容易知道用偏振光检测器可以得到包含2个以上立体手性中心的化合物的有用信息。

药品拉贝洛尔同分异构体的结构可以用图8解释，大部分小分子药物制备体表现出的特定旋光性在10和40度之间。

抗生素和糖：没有生色团的化合物

大部分抗生素和糖类物质没有生色团但却表现出特定的在100度以上的旋光度。这意味着对小分子药物制备剂而言以吸收为基础的检测器（紫外和圆二色谱）将失效，而ALP将有很大高的灵敏度。

像庆大霉素和红霉素等抗生素有多种结构上的类似物，这类似物在质量上的差别通常小于2%，而且紫外检测器在220纳米以上时通常无法检测，但对此类似物尽管其结构上的差异很小，可其比旋光度却有很大的不同。所以ALP不仅可以检测出来类似物而且可以通过其特定的旋光度确认抗生素种类。

在细菌感染对生命造成潜在威胁时庆大霉素可以提高人的抵抗力，但庆大霉素的治疗范围不宽，过量的庆大霉素会引起肾和听觉神经的损害，所以需要持续地观察，出人意料的是庆大霉素的化学性质稳定并在动物饲养界应用很广。在不损失生物活性的情况下庆大霉素可以在不断升温的环境中保留一段时间。

ALP可以持续的测量手性物质的信号和旋光度，通过保留时间来指示氨基酸种类。ALP可以在不持续用外标物时就定性和定量分析氨基酸。

天然产物

天然物是手性的并且可以表现出旋光度。很多化合物仅以一种对映体形式表现出手性。存在于柑桔类水果、香菜、时罗叶、佛手桔等中的聚柠檬烯和油性化合物等有l和d两种手性结构。柠檬烯的比旋光度大约是101度。

食物、味精和香料

由于尝的和闻的是手性化合物的效应，食物、味精和香料也可以用ALP进行分析。

肥料和杀虫剂

许多手性小分子物料在提高效力和专一性并减少毒性上效果显著，因此许多新的和在开发的肥料和杀虫剂都是手性的。ALP在分析和控制这些化合物的合成过程中非常有用。

P、P‘-DDT和P、P‘-DDD这两个声名狼藉的杀虫剂是让环境化学家非常头疼的。因为它们是不可降解的和生物活性。作为杀虫剂，它的生物活性超过了它的毒性，而且它对脊椎动物的毒物活性还是不可预测的。除此之外这些还是一类被指出有内分泌干扰功能的化合物。因此监测土壤、地表和地下水中的DDT和DDD的含量有非常重要的价值。

尽管这两个杀虫剂都是手性的，但却没有表现出旋光度，商业生产的制剂中含有OP‘对映体类似物10-20%，这是有旋光度的（见图13），通过监测环境样品中这类似物的存在，就可大体确定手性物的存在，从而暗示出有毒化合物的存在。

1.5 应用

大部分ALP用于测量、方法开发、准备工作纯化和过程控制，如下面所描述那样，在其它的应用上只对旋光度灵敏是其独一无二的特点。由于不依赖吸收效应，可以在对分析物和过程问题的分析中改变溶剂，如ALP可以通过减少或增加分离物和要求的标准物来简化分析和对复杂的有机化合物中手性化合物的监测过程

分析（数量分析和质量分析）

ALP检测流通池中的含有物的净旋光度的方向和含量。当在HPLC和SFC系统的紫外检测器后再接一个ALP，紫外检测器可以通过检测吸光度来反映样品质量，而ALP则检测其旋光度，如可得到紫外和ALP检测器的相对响应系数，可以实时对对映体峰重叠部分和对映体超出部分的峰进行卷积。计算比旋光度将会更容易。

例子一：剩余在牛奶中的抗生素——庆大霉素的质量控制和质量管理：

在细菌感染对生命造成潜在威胁时庆大霉素可以提高人的抵抗力，但庆大霉素的治疗范围不宽，过量的庆大霉素会引起肾和听觉神经的损害，所以需要持续地观察，出人意料的是庆大霉素的化学性质稳定并在动物饲养界应用很广。在不损失生物活性的情况下庆大霉素可以在不断升温的环境中保留一段时间。庆大霉素的四种光学活性类似物如图14的图片所示。

上图显示的是用ALP检测器对两种不同商家提供的庆大霉素类似物的分析，分离用的是反相、离子交换柱，洗脱液的组成是甲醇和0.4MTFA/H₂O（80：20，V：V），流速为0.75ml/min，总进样体积是10μg。

这是第一个用单一分离系统对四种庆大霉素类似物进行彻底分离。ALP可以在不用衍生化反应检测出低于50ng的庆大霉素，用紫外检测器时，衍生化反应增加的剂量决定了整个色谱分离的衍生物的特性，从而使分离开四种同类物几乎成为不可能。随着四种同类物的分离，两个商家提供的样品中所含的四种化合物的不同清晰地表现出来。判断衍生物庆大霉素的来源就有了可能。

早先由于检测和分离四种类似物很困难，只报道过对映体混合物的旋光度，随着四种庆大霉素类似物的分离，ALP可以用来决定四种物质中每一种物质的旋光度，首先用示差折光检测器指出分离试验中每一种对映体的相对质量，用检测每种物质旋光度和相对丰度，可以得到混合物的计算量，这个计算量和文献中找到的可接受值一致，结构上这四种物质也可以真正地鉴别开来。旋光度可以清晰地分离不仅反映出ALP检测器的灵敏性，而且表明了旋光度和靠近或在手性中心的原子的密切关系。

为了检测可能有污染物的大量牛奶样品，检测方法必须是快速且灵敏的。选择ALP检测器在这个应用中是有很大的优势的。如果用此方案。用0.1mol三氟醋酸酸化牛奶样品，离心分离5min，取上清液注入HPLC。HPLC的条件和上面的一样，离子对分离。紫外检测器显示出大量的化合物存在提取液中，然后它们中的大部分没有旋光度而不能让ALP识别，我们期望分离的物质在2min后被洗脱出来，用ALP检测器，庆大霉素污染物很容易观察出来 而含有庆大霉素污染样品的提供者也可以很快确定。整个分析过程不到15min，与用紫外检测器抽提、清洗和衍生化方案相比，这是一个很大的进步。紫外检测器是需要好几个小时才能检测出来，所以基本排除了在大量的牛奶样品检测上应用的可能性。

HPLC/SFC方法开发

ALP的使用是手性方法，因为他们可以不考虑溶剂就精确地识别对映体并在非手性杂质和手性物质混合时显示对映体的分离。含有多个手性中心的化合物表现出了对映体之间旋光度的明显差别。这个特点使ALP更容易在非对映体异构体和复杂的化合物的分离中识别和定性各个峰。

HPLC/SFC预纯化——片段收集器

ALP是手性预处理中选择的检测器，他们表现出可持续地检测旋光度且不被手性化合物和溶剂影响。ALP可以正常使用很长时间而不用校正和特别保养。非常重要的线性波支范围上ALP也比任何其它以吸收为基础的检测器技术更好，而流通池技术也是几乎和任何其它应用相适应的。大部分用ALP的预处理实验可以用ALP系统完成收集，而紫外检测器则另外单独寻找手性杂质。

在线监测

以下部分演示了用ALP监视的将有一种旋光度的手性反应物转变为一个有不同旋光度的产品的过程，图17显示了在葡萄糖氧化酶催化以下反应过程中如何改变旋光度的。反应物β—D—葡萄糖的旋光度是53（deg.(g/ml)^-1dm^-1）,而产生葡萄糖酸的旋光度是12.7（deg.(g/ml)^-1dm^-1），因此反应结果用旋光度α的净改变量表示大约是30。它很容易用ALP测量出来。

在此实验中，反应是在偏振光检测器流通池中进行的。下面我们将演示怎么以固定的时间间隔从反应器中提取样品并用ALP分析。当然为了实时控制连续运行的反应系统，此检测器可以作为在线监视器作其它用途。

图18的数据显示了ALP怎样利用流动进样分析系统引入样品的，葡萄糖和葡萄糖酸注射量加倍后，大约40秒后分离并核实洗脱顺序和检测器对两个有旋光度的化合物的响应值。

β—D—葡萄糖先洗脱下来，比2分钟后洗脱下来的D—G—葡萄糖酸的响应值大，这和文献中报道的α值相一致。这给了我们一个快速准确分析反应系统的有用工具。图19中，我们把ALP响应值作为β—D—葡萄糖分子片段的函数，在此显示出的数据显示出当一个有手性的化合物转为一个旋光度不同或无旋光度的化合物时用一个偏振光检测器可以很容易地 反应过程。

当用葡萄糖酸的分子片段绘图时可以得到一个相似的曲线，只是因为葡萄糖酸的旋光度更小一些使斜率更小。

图20展示了收集数据制成的图，此图解释了在用在线分析和控制优化涉及手性化合物的反应时的一些潜在可能性。通过偏振光检测器葡萄糖转为葡萄糖酸，用FIA将来自反应器中的样品注入ALP，在此实验中，反应时间50分钟。然而其它的研究扩展到长达12小时，酶本身的旋光度导致了反应培养基开始旋光度的不同。

我们可以清晰地看到主要是葡萄糖氧化酶催化剂数量的增加导致了反应速率的上升。需要注意此时没有使用分离。通过用FIA，每个样品用不到3分钟来分析收集数据的潜在增加值并和其它技术如HPLC作对比。

在下页的表2中，我们列出了适合用ALP检测器监测的大量药物和工业用酶系统，这些系统的任一个都将受益于ALP的优化过程。

ALP可用在许多大规模分离应用如液相分析和SFC以及模拟移动床系统上。ALP可以用在任何规模的反应器或结晶罐中的化合物的旋光度的实时变化的监测上。旋光度的变化是对映体的浓缩或手性反应物转变为旋光度不同的手性产品的结果。一般这些测量可以实时取得并不需分离过程中关闭来自反应器的循环流路。ALP测量不受吸收值改变的影响，也不受测量流中没有旋光度的干扰物的影响。

1.1              概要和结论

在过去10年里ALP在应用表现和用户接受度上都取得了重大进展，在手性色谱分析中如果不用现代激光的ALP将是不可能的。ALP理所当然地支持手性色谱分析，这会带来ALP在产量，稳定性和精确度上的提高，合理设计的ALP流通池也适用于HPLC、SFC和SMB，以及覆盖从微克到吨级的样品尺寸的应用过程。他们很容易自动化并不需要定期的校正和维修。